Pyrosequencing进行SNP分析方法Pyrosequencing的原理Pyrosequencing是精确和稳定地对大量的短到中等长度的DNA序列样品进行分析的技术。第一步，测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶-DNA聚合酶（DNApolymerase）、ATPsulfurylase、luciferase、apyrase-和底物-adenosine5´phosphosulfate(APS)、luciferin孵育。第二步，四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A-T，C-G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。注意：反应时deoxyadenosinealfa-thiotriphosphate(dATPS)是deoxyadenosinetriphosphate(dATP)的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是luciferase的底物。第三步，ATPsulfurylase在adenosine5´phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。ATPsulfurylasePPi+APS→ATPLuciferase，ATPLuciferin→oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第四步，ATP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。第五步，然后加入下一种dNTP。在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram的信号峰中决定。利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。最佳化的PyrosequencingPyrosequencing反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%（PyrosequencingPSQ96System）。*底物浓度已最佳化*选择了Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS*dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入*ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目*仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量待测模扳制备通过PCR技术将待测序列扩增，其中引物之一用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。系统的优点可靠的化学原理和强有力的检测机理使的该系统不需要胶、染料或特异标记，测序事件可以实时检测。*快速、高通量、重复性好-10分钟内分析96个SNP或每小时处理500个样品或每六秒处理一个SNP*简单-带有软件和为SNP分析特异设计的SNP试剂KIT的台式仪器*强有力-标准格式，标准操作程序，勿需胶或tags*灵活性-每个实验孔（testwell）可以进行一个SNP或一个样品的分析*序列信息-PSQ96系统也能提供序列信息，确保所产生资料的高精确度和可靠性PSQ96系统如何工作PSQ96系统利用Pyrosequencing技术为每个SNP测定10个以上碱基*带有退火引物的单链DNA模扳放入PSQ96孔板*酶混合物,底物和核苷酸（PSQ96SNPReagentKit）放在PSQ96试剂舱（ReagentCartridge）*PSQ96孔板和试剂舱放在仪器中*含SNP位点的序列输入SNPEntry软件包.*SNPEntry软件包自动建议核苷酸的分配顺序，以条形图（bargraphs）形式展示三个可能的理论结果*运行中每个孔的测序过程实时展示，可以用所有的孔或选定的孔。通过从已经输入SNPEntry软件包的SNP列表中选择，每个孔能安排分析一个独特的序列*运行结束后，用SNP软件评估资料，通过比较原始资料和理论数据，确定每个样品的基因型SNP软件AQ产品信息*在大量DNA样品中定量化等位基因频率1.自动计算等位基因频率2.统计计算*产生SNP序列数据库*预测SNP分析的理论结果*进行基因型分析*进行原