实验1微生物抗药性突变株的分离基本原理：抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的鉴别手段。在含有一定浓度抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。本实验用常用的梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。操作步骤：1．接种大肠杆菌于盛有5mLLB培养液的试管中，37℃振荡培养24h。2．在热水浴中融化LB琼脂培养基。3．倒10mI。已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中，将培养皿一端垫起使培养基表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固。4．在凝固的平板底部高琼脂一边标上“低”，放平后在底层培养基上加人每毫升含有100ug链霉素的LB琼脂培养基10mL。，凝固后制得链霉素浓度从一端的0ug／ml。到另一端的100ug／ml。的梯度平板。5．用1mL。无菌吸管吸取0.2ml。大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进平皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。6．将平板于37℃培养48h。7．选择1～2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。8．将平板倒置于37℃培养48h。实验结果：图示经一次培养和二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。【注意事项】1．制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。2．严格无菌操作，勿将杂菌误认是抗药性大肠杆菌。实验2紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80％是254nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA结构变化而造成的。DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活。因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射。注意，经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。【实验内容】(一)诱变1．菌悬液的制备取已培养20h的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，并倒人盛有玻璃珠的锥形瓶中。强烈振荡10min，打碎菌块，将此菌悬液用无菌移液管吸至10mL离心管中，3000r／min离心15min。弃上清液，将菌体用无菌生理盐水10mL洗涤2次，最后用10ml，无菌生理盐水制成菌悬液。用无菌移液管移人另一锥形瓶中，调整细胞浓度为108／ml。细胞悬液浓度可用平板活菌计数法测定，也可用光密度比浊法测定。2.平板制作将淀粉琼脂培养基融化后，冷至45℃左右，每人倒平板9个，凝固后待用。3．诱变处理（1）预热正式照射前开启紫外灯，预热20min。（2）搅拌取制备好的菌悬液4mL移入直径为6cm的无菌培养皿中。放人无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，在20w紫外灯下30cm处进行照射。（3）照射打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1min、2min、3min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。4．稀释涂平板先取未照射的菌悬液0.5mL加到4.5mL生理盐水中，稀释至10-6、10-7、10-8作为对照(每条桌子有2人做即可)，然后在红灯下打开紫外灯进行照射1min、2min．3min；取照射1min的菌悬液0.5mL到4.5mL生理盐水中，稀释至10-6、10-7、10-8；取照射2min菌悬液0.5mL，同上方法稀释到10-7，照射3min菌悬液稀释到10-6；取最后3个稀释度的稀释液各0.1mL，涂于淀粉培养基平板上；每个稀释度涂2个平板，对照做3个稀释平板。用无菌玻璃刮棒涂匀。用黑布包好照射过的平板，37℃培养48h。(二)计算存活率及致死率1．存活率(1)对照样品中活菌数将培养48h后对照平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。(2)照射后样品中活菌数同上，计算照射1、2、3min后样品1mL菌液中的活菌数。根据公式计算存活率。2．致死率同样计算用紫外线处理1、2、3min后的致死率。（三）观察诱变效应在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC值)，与对照平板进行比较，根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶诱变的效果，选取HC比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面培养基上培养。此斜面可作复筛用。【实验报告内容】(1)将实验结果按表要求如