高级生化技术实验实验内容安排40学时掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质；掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；通过实验应该做到实验前应认真预习，写好实验预习报告。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。实验预习报告格式①实验原理②实验方法与步骤（表格或流程式）③主要仪器、材料④实验数据记录表格⑤预习遇到的问题实验记录与实验报告考核方式与评分方法实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化【目的要求】鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。透析纯化离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要脱盐才能得到纯品，一般采用透析的方法。【操作方法】4)量取100mLSephadexG-25,加入200mLpH6.5的磷酸盐缓冲液，沸水中1h。冷却后脱气。2)装柱（小心操作）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。实验二SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量【目的要求】【实验原理】CH2=CHSDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。SDS-PAGE：在PAGE中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少，分子的大小和形状。如果在PAG系统中加入阴离子去污剂SDS（十二烷基磺酸钠），蛋白质分子表面完全被负电荷所覆盖，电泳时，其迁移率取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷和形状无关。当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=K-bm将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-Gly缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性。浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应分子筛效应分子筛效应【操作方法】1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶）将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将贮槽的蒸馏水倒去，用细条滤纸吸去残留的水液。将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，30min左右，上胶即可聚合，再放置10-20min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。3、蛋白质样品的处理b)称制备样品1mg，按1mg/mL溶液比例加样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。Stakinggel7、结果处理【注意事项】【思考题】实验三凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【目的要求】【基本原理】相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从一个胶粒孔隙进入另一凝胶颗粒，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外均有分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。Vo（外水体积）：Vo等于被完全排阻的