第二章分子克隆工具酶一、限制性核酸内切酶2.来源限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（2）识别序列EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）EcoRI等产生的5‘粘性末端CTGCAGPstI等产生的3‘粘性末端PvuII等产生的平头末端①连接便利③补平成平齐末端识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）切口酶在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（9）DNA末端长度对限制酶切割的影响PstI（10）位点偏爱（11）酶切反应条件（12）星号（*）活性3.III类限制性内切酶（＜1%）4.归位内切酶1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37度，少数要求40-65度。是影响限制酶活性的重要因素。五、限制性内切酶对DNA的消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。4.限制酶酶切反应的终止6.限制性内切酶识别序列的交叉列表一、限制性核酸内切酶二、限制性内切酶的类型I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切三、限制性内切酶的命名四、影响限制性内切酶活性的因素五、限制性内切酶对DNA的消化第二节甲基化酶1.功能：在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。EcoKⅠ甲基化酶识别位点少,识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置,但因为识别位点少（1/8kb），所以研究较少。3.甲基化对限制酶切的影响②产生新的酶切位点第三节DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶1.共同特点三、DNA聚合酶在基因工程中的用途①底物：标记标记③DNA聚合酶I对探针序列的标记5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。纯化的DNA片断2.Klenowfragment①3’端补平③cDNA第二链的合成（1）T4DNA聚合酶的性质③特点（2）T4DNA聚合酶的用途酶切中间产生两个末端标记a.放射性标记的优缺点：b.非放射性标记纯化的DNA片断光促生物素标记抗生物素蛋白（avidin）：ii）地高辛标记：iii）偶联酶及其底物iv）用非放射性标记的探针检测原理4.T7DNA聚合酶（2）T7DNA聚合酶的特点②进行末端标记5.耐热DNA聚合酶6.逆转录酶（3）逆转录酶的用途7.末端转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）TdT的基本特性：第四节其它分子克隆工具酶一、连接酶（1）必须是两条双链DNA。连接酶反应的最佳温度是37C。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。DNA连接酶OHDNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶二、T4多核苷酸激酶3.多核苷酸激酶的用途三、碱性磷酸酶2.碱性磷酸酶的特性四、核酸酶2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）4、单链核酸内切酶：S1核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶